|
對于做分子實驗的人來說,，探針引物，一個很熟悉的詞語,，科研人員也會經(jīng)常用到,，但是對于探針引物的設(shè)計，您知道多少,？今天,，我們就簡單的談下這種引物的設(shè)計。
通用原則
-
先選擇好探針,，然后設(shè)計引物使其盡可能的靠近于探針,；
-
擴增子的長度應不超過400bp，理想的最好能在100－150bp內(nèi),，擴增片斷越短,，有效的擴增反應就越容易獲得，較短的擴增片斷也容易保證分析的一致性,；
-
保持GC含量在20％和80％之間,，GC富含區(qū)容易產(chǎn)生非特異反應，從而會導致擴增效率的降低,，及在SG分析中非特異信號,；
-
為了保證效率和重復性,，應避免重復的核苷酸序列，尤其是G（不能有4個連續(xù)的G）,；
-
將引物和探針互相進行配對檢測,，以避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)的形成。
探針設(shè)計指導
-
在設(shè)計引物之前設(shè)計探針,；
-
探針的Tm值應在68－70℃之間,，如果是目測探針，則要仔細審查GC富含區(qū),；
-
探針的5'端要避免有鳥氨酸,，5'G會有淬滅作用，即使被切割下來這種淬滅作用也還會存在,；
-
選擇C多于G的鏈作探針,，G的含量多于C會降低反應效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針,；
-
探針應盡可能的短,，不要超過30個bp；
-
檢測探針的DNA折疊和二級結(jié)構(gòu),。
引物設(shè)計指導
-
引物的Tm值應在58－60℃之間,，這非常重要，因為我們的試驗一般都使用退火溫度為60℃,，在這個溫度下,，5'核酸外切酶的活性****；
-
引物末端（最后5個核苷酸）不能有超過2個的G和C,；
-
將引物盡量接近于探針,。循環(huán)參數(shù)當引物和探針按照上述原則設(shè)計好后，循環(huán)的參數(shù)也就確定了,，當經(jīng)過起始的變性溫度后(根據(jù)Tag酶要求設(shè)定),，反應要經(jīng)過95℃，15－20秒,，60℃,，60秒，對于一些模板,，45秒也足夠了,，數(shù)據(jù)在退火時檢測。
優(yōu)化探針和引物的濃度
對于雙探針反應,，通過選擇探針和引物的濃度來優(yōu)化反應結(jié)果,，能獲得最低的CT值，以及相對于背景來說熒光值有****的增長。引物濃度應該在50nM-900nM 范圍內(nèi)進行優(yōu)化,，探針濃度應該在50－250nM范圍內(nèi)優(yōu),。
探針的濃度應該從（50，100,，250nM）與引物濃度相組合,，在Rotor-Gene上進行試驗，選擇最小CT值和****反應擴增的曲線做后續(xù)試驗,。
通常所用的探針和引物濃度分別為250nM 和900nM,，絕大多數(shù)反應都可以在這個濃度下進行，但為了尋找****的濃度,，還是應該依照上述的步驟,。由于引物溶解溫度預測的差異和多種探針設(shè)計程序，因此使用三種退火溫度（58℃,，60℃,，62℃）對優(yōu)化是很有用的。
引物的濃度也會影響溶解溫度,，高的引物濃度會讓溶解溫度提高2度左右,。Primer3是個非常有用的軟件，但它不能避免3'端的G,，所以應將3'端的G去除,，并觀察探針的退火溫度是否比引物高8－10度。
定量數(shù)據(jù)的分析
分析定量數(shù)據(jù)主要有兩種基本的方法：絕對定量和相對定量,。研究人員應該根據(jù)擴增子和試驗目的來決定如何分析定量數(shù)據(jù),。
（1）絕對定量
絕對定量是將未知樣品與標準曲線相比較進行分析，一般標準品就是一個已知絕對濃度的DNA樣品,，關(guān)于何種標準品用于標準曲線一直有很多討論,，理想的標準品其擴增方式應該是與待測樣品一致得，然而這往往是不可能的,。一些人會克隆他們得目的基因，并與未知樣品比較,。要注意得是,，絕對定量分析的準確性是依靠標準品的準確性得。
在Rotro-Gene 上可以用幾種方法來分析絕對定量數(shù)據(jù),。包括標準曲線在內(nèi)的R值,，反應效率都會被呈現(xiàn)出來。也可以從以外的分析中調(diào)用標準曲線并讓它與一個標準品相調(diào)整,，（或重復相同的標準品）,，這個功能在確定斜率的重復性好與Y截距的基礎(chǔ)上完成。對一個標準曲線來說，一個單獨的標準品就已經(jīng)足夠了,，也可以在不同的通道甚至一個通道內(nèi)繪制多條標準曲線,。
（2）相對定量
相對定量是指兩個或更多的基因互相進行比較，其結(jié)果是一個比率,，沒有確切的數(shù)字被檢測道,。一種檢測基因表達相對定量的方法叫"比較CT值法（⊿⊿Ct）"，這種方法可以徹底不需要標準曲線,，通過觀察與一個動態(tài)相關(guān)對sPCR照比較的表達水平,，從而可以將模板與增加的樣品間進行相對定量。要使這種方法成功,，目的及參照的動態(tài)范圍應該相類似,。
相對的一個敏感的方法就是看⊿Ct（相同的起始模板濃度，兩個擴增子的兩個CT值的差異）隨著不同稀釋度的模板有什么變化,。如果兩個擴增子的反應效率大致相同,，則the plot of log input amount versus ⊿Ct 將是一條水平線（斜率<0.01）。這意味著在初始模板濃度范圍內(nèi),，兩個擴增子有相同的反應效率,。如果檢測發(fā)現(xiàn)效率不一致，則應該用標準曲線來對基因表達進行定量,，或優(yōu)化反應獲得一個類似的效率,。
|
|
