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Western Blot原理介紹
Western Blot（WB），即蛋白免疫印跡法，是定性、定量檢測蛋白表達(dá)的一種經(jīng)典、有效的技術(shù)方法。western blot是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。Western blot是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)。由于western blot具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。Western blot常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。
Western Blot方法非常成熟，大多實(shí)驗(yàn)室均具備Western Blot的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰Α５且玫揭环荼尘扒逦l帶明亮、真實(shí)客觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要投入大量的時間和精力，信諾金達(dá)生物技術(shù)人員，在樣品處理、轉(zhuǎn)印和抗體稀釋比例等操作上具有特殊的技巧，能夠?yàn)榭蛻舻臉悠妨可矶ㄖ茖?shí)驗(yàn)方案。
Western Blot技術(shù)路線
Western Blot服務(wù)優(yōu)勢
1. 高分辨率的電泳技術(shù)：聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel，PAGE）把分子篩作用和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，達(dá)到更高的靈敏度。
2. 特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)：抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上是抗原表位與抗體超變區(qū)中抗原結(jié)合點(diǎn)之間的結(jié)合。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。
3. 1-5ng中等大小的靶蛋白：可檢測到低至1～5ng（最低可到10～100pg）中等大小的靶蛋白。
Western Blot服務(wù)要求
需新鮮或正確保存的蛋白樣品或者蛋白粗提液（總蛋白濃度不低于 2μg/μl（至少50μl）。）；或者不少于50mg組織樣品，或者不少于5×10的6次方個細(xì)胞的細(xì)胞樣品。
陽性對照樣品（如果有）。
檢測目的蛋白的一抗（自備或者如果是常用的信諾金達(dá)會有備貨，不常用的可由信諾金達(dá)訂購）。
Western Blot步驟
1、蛋白質(zhì)抽提
A、實(shí)驗(yàn)對象為組織樣品，取適量（250-500mg）新鮮組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白。
B、實(shí)驗(yàn)對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×10的6次方～1×10的7次方細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白。
2、蛋白質(zhì)定量
按KCTMBCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。
3、變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)
將準(zhǔn)備好的樣品液和生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)第一個孔中，電泳分離蛋白。
4、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或PVDF膜
5、膜的封閉和抗體孵育
A、膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時以封閉膜上的非特異結(jié)合。
B、封閉過的膜加入一級抗體室溫孵育1.5小時，抗原抗體結(jié)合。
C、加入HRP標(biāo)記的二級抗體以結(jié)合一級抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1小時。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時檢測GAPDH含量。
6、結(jié)果檢測
化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值的數(shù)字化。
7、數(shù)據(jù)分析
目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。
8、提供實(shí)驗(yàn)報告
包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
Western Blot實(shí)驗(yàn)交付內(nèi)容
實(shí)驗(yàn)交付內(nèi)容包括：蛋白濃度，膠片，膜，以及灰度分析（如果需要）及實(shí)驗(yàn)報告。
實(shí)驗(yàn)范例圖片： 
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